高光谱成像技术实现马铃薯叶片叶绿素及病害联合检测

一、马铃薯叶片的特征参数选取与叶绿素测定 

高光谱图像中包含了丰富的光谱信息和图像信息，相较于多光谱，高光谱成像中波段的增加使对物质的特性描述更加准确，可为研究人员提供足够量的数据用于物质的分类识别和预测。然而，信息量的增加必然会导致信息冗余，增加数处理分析的复杂性和难度。如果只研究目标物体中某一物质的特性或含量多少，用全波段光谱数据显然会加大其中的工作量，使研究意义降低。 

因此，需要用到特征参数提取的方法用以去除全波段n个数据中与被研究目标无关的高光谱数据，选取能够准确反映被研究目标特性的m个光谱数据，这m个数据即为该研究对象的高光谱特征参数。目前，光谱特征参数选取的方式主要分为两种： 

（1）光谱特征选择，即针对被研究对象，选择全波段光谱中的某些波段的光谱数据作为被研究对象的特征参数。这些波段包括了该物体的主要特征光谱，并且能够最大程度地与其他物体区别开来。光谱求导，相关系数法、连续投影算法等方法都属于该特征参数提取方式。光谱特征选择过程如图3.1所示。

（2）光谱特征提取，它是基于各波段光谱重新组合优化提取研究对象特征参数的过程，其目的与光谱特征选择一致。主成分分析（PCA）、植被指数计算等方法都属于该范畴之内。图3.2是光谱特征提取流程。 

二、高光谱图像的采集与掩膜处理 

使用高光谱分选仪采集到的马铃薯叶片图像，在未经过任何处理之前，其中只含有叶片的光谱响应值数据。若使用叶片的光谱反射率数据进行研究，则必需首先对图像做反射率校正，光谱响应值在校正后转化为光谱反射率，并能初步缓解采集过程中噪声对整幅图片的影响。图像校正后需使用掩膜屏蔽其中的背景信息，只保留叶片的光谱信息，保证原始光谱数据准确性，便于展开后续研究工作。

1.研究对象 

本文以马铃薯叶片为研究对象，研究所用样本叶片均摘自云南师范大学生命科学学院的马铃薯试验种植基地，采摘时间为2019年秋季，总计得到80个可用样本叶片。为保证研究结果的准确性，所用样本叶片随机摘自试验基地内生长状况良好、健康、无病害侵染的不同马铃薯植株。选择总样本数量的75%，即60个样本叶片作为训练集，剩余样本作预测集使用。摘得的马铃薯样本叶片将用于本章的高光谱图像采集、叶绿素测定、光谱预处理和特征参数提取以及后续章节的叶绿素反演模型的建立。 

2.马铃薯叶片的高光谱图像采集与反射率校正 

使用高光谱分选仪于暗室环境中（尽量去除环境光对图像采集的影响）采集样本叶片的高光谱图像数据。所用的分选仪与高光谱相机参数已由上述表给出。在本文使用256波段的采集模式来获取马铃薯叶片高光谱图像数据。 分选仪开预热并进行高光谱采集工作。图3.3（a）是采集的部分样本叶片的高光谱图像，右边黄色区域为光源照明下的标准白板；随机取图像中7点位置，其光谱响应值（DN值）曲线如图 3.3（b）所示，由于噪声影响（仪器噪声、环境噪声等），在响应值曲线中出现许多因噪声导致的毛刺。必须对原始图像进行反射率校正和计算，获得较为准确的叶片的光谱反射率数据，具体方法是：

控制电位移平台移动，将标准白板对准高光谱相机镜头，采集标准白板的光谱响应值，作为白帧 W；盖上镜头盖，关闭卤素灯，采集无光条件下的光谱响应值，记为黑帧 D。设原始高光谱图像的响应值为 R(DN)，根据公式（3.1） 

计算出校正后的光谱响应值 R′(DN)。再通过数据归一化，得到校正后的光谱反射率，经计算机输出一幅含有物体反射率信息的高光谱图像。图 3.4（a）则是反射率校正后的马铃薯叶片高光谱图像，对比图 3.3（a），从视觉能看出图中标准白板区域已校正为原有的白色，图 3.4（b）是叶片上7处位置与标准白板上1点位置对应的光谱反射率曲线，可以看出，校正后曲线上的噪声毛刺被去除，光谱反射率归一化到0-1之间，黑色曲线对应标准白板的反射率，其反射率接近于1或者100%。 

3.图像掩膜 

掩膜是图像处理中常用的一种方法，它的实现过程是选定一张图像或图形，对待处理的图像进行遮挡，提取出遮挡或者是未遮挡部分图像。用于遮挡的图像或图形被称为模板或掩模，在光学图像处理中，掩模可以是胶片、滤光片、遮光板等，数字图像处理中，掩模为二维矩阵数组，有时也用多值图像[46]。在处理高光谱图像时，掩膜主要用于以下几个方面[47]： 

（1）感兴趣区域提取，将事先手动绘制好的感兴趣区作为模板，与待处理图像进行乘法运算，得到感兴趣区图像，在感兴趣区内的图像信息与原图像一致，区域外的图像信号值则变为0； 

（2）起屏蔽作用，用模板图像屏蔽待处理图像中的某个区域，使该区域中所有的图像信息不参与后续的图像数据处理，或仅对屏蔽区内的图像进行统计或处理； 

（3）提取结构特征，由于模板图像具有一定的结构特征，可以将模板的结构特征与待处理图像结构特征做对比运算，从待测图像中提取与模板结构特征相近似的区域用做进一步处理分析。 

（4）制作特殊形状的图像，其原理与提取感兴趣区域一致，是裁剪图像的一种方式。

根据图3.4（a），经反射率校正的高光谱图像还包含有背景信息（黑色的电位移平台），对该图像进行数据处理时，背景信息会对马铃薯叶片信息产生一定的影响，降低其数据可靠性，因此，使用掩膜中感兴趣区提取的方法对高光谱图像进行处理，去除图像中的背景信息，只保留马铃薯叶片区域的光谱信息，便于后续的光谱预处理、特征参数选取以及建模等工作的开展。 使用ENVI5.1软件对马铃薯叶片高光谱图像做掩膜处理，先提取马铃薯叶片部位的感兴趣区，再将区域外背景值设置为0，屏蔽掉背景信息。掩膜结果见图3.5，（a）图是反射率校正的马铃薯叶片高光谱图像，红线区域内为手动划分的感兴趣区，（b）图是掩膜后的马铃薯叶片图像，可以看出，叶片上的黄色、黑色病变斑点在掩膜后的图像中能更加清楚的分辨出来。 

图3.6为80个马铃薯样本叶片的高光谱图像在经过反射率校正与掩膜处理，提取的叶片平均光谱反射率曲线。 

三、马铃薯叶片叶绿素含量测定 

目前，叶绿素含量测定方法主要有荧光分析法、活体叶绿素仪法、分光光度法和高效液相色谱法。前三种测量方法大都利用叶绿素的光学特性来确定其含量多少，高效液相色谱法则是利用叶绿素的层析色谱原理，实现叶绿素的定量检测。本节就这几种主要的叶绿素测定方法做简要介绍，并利用分光光度法，测定实验所用样本叶片的叶绿素含量。 

1.常用叶绿素测定方法简介 

荧光分析法利用了叶绿素的荧光特性，叶绿素分子被紫外光照射后可发射出红色荧光，其荧光强度与叶绿素浓度呈正比，据此可采用荧光法进行叶绿素a的定量分析[48]。先使用荧光光度计测定不同浓度梯度的叶绿素标准提取液（一般为丙酮溶液）中叶绿素荧光值，绘制叶绿素荧光工作曲线，如图3.7所示，对该曲线进行回归，得出回归方程[49]；之后测得待定样本的叶绿素荧光值，代入上述回归方程计算得到相应的叶绿素浓度，再将浓度值代入相关叶绿素含量计算公式得出叶绿素含量。该方法最主要特点是灵敏度高，对叶绿素检测能力达到ug/L的级别，常用于水体等叶绿素含量不明显物质的检测，其缺点是操作繁琐，测定效率相对较低。

活体叶绿素仪法主要是使用叶绿素仪对植物叶片进行叶绿素检测，其基本工作原理是叶绿素仪通过发射两束不同波长的光束透过叶片，在光线接收端测定两种波长光束的透光系数，用以确定叶片当前叶绿素含量相对值，即叶绿素SPAD值。下图是目前常用的便携式叶绿素仪，可实时监测植物叶片的叶绿素含量，但是缺点也较为明显，从图中可以看出，叶绿素仪一次只能测量叶片中某点位置的叶绿素值，需多次测量才能反映该叶片叶绿素含量情况，易受人为主观因素影响，其测量精度相对偏低。 

分光光度法与荧光分析法原理类似，利用叶绿素对光的选择吸收性，使用可见光分光光度计测得叶片叶绿素提取液（80%丙酮溶液或95%乙醇制取）在特定波长下（645nm、652nm或663nm，常用652nm）的光吸收度，代入叶绿素计算公式即可得出待测样本的叶绿素含量。分光光度法是目前测定叶绿素的最常见方法，该方法测定过程相对简单，结果准确；其麻烦之处在于叶绿素提取液的制备，制备过程漫长，平均制备一个样本的叶绿素提取液需要20-30分钟。 

高效液相色谱法是测定叶绿素含量的另一种较为常用的方法。它的工作原理较为复杂，在此只进行简要概述。高效液相色谱法是基于色谱法，以含有成分的待测液体为流动相，采用高压泵系统，将流动相泵入装有固定相（固定相用于分离流动相中各个色素）的色谱柱内，当经过色谱柱的叶绿素被分离后，送入检测器内进行检测，实现对待测样本的叶绿素含量测定。高效液相色谱法有高速、高效的特点，它分析速度快，对待测样分离效能高，广泛用于有机化合物的分析中，也是叶绿素测定的方法之一，缺点是对流动相的流型要求较高，任何测定过程中的流型改变都会影响色谱峰加宽，导致其柱效率降低，进而影响测量速度与精度。 

2.本文所用叶绿素测定方法 

本文采用分光光度法测定马铃薯叶片的叶绿素含量，每批次马铃薯样本叶片的高光谱图像采集完成后，需立即将叶片送至生物实验室对其测定。具体操作过程如下： 

（1）用电子天平称取一片马铃薯叶片的重量，记为mg。 

（2）将叶片剪碎置于研钵中，加入少量经灭菌后的石英砂和碳酸钙粉末以及体积分数为95%的酒精，将其研磨至叶片组织变白（一般研磨3-5min），再加入适量的酒精将其研成匀浆，于室温暗处静置10到15分钟，等待叶片中的叶绿素充分溶解到酒精溶液中。 

（3）使用滤纸和玻璃漏斗把匀浆过滤到25mL 容量瓶中。用滴管吸取酒精溶液洗净研钵，清洗液也全部过滤至容量瓶中，继续用酒精清洗吸附在滤纸上的叶绿素，待滤纸与残渣全部变白后定容至25mL，制得该样本叶片的叶绿素提取液。 

（4）使用分光光度计测得叶绿素提取液在波长为652nm处的吸光度，记为A652，利用公式（3.2） 

计算提取液中叶绿素总质量浓度c（单位: mg/L），其中34.5是叶绿素在光波长652nm处的吸光系数，不同波长下的叶绿素吸光系数不同。通过公式（3.3） 

得出该样本叶片的叶绿素质量分数ω（单位：mg/g），也就是叶绿素含量。式中V为叶绿素提取液体积，本文中V取25mL。图3.9是叶绿素测定过程中所用的主要材料、仪器与设备，包括石英砂和碳酸钙粉末（已灭菌）、95%体积分数的酒精、电子天平（精确到0.001g）、分光光度计检测系统；叶绿素测定实验在生命科学学院的生物实验室中完成。 

所有样本叶片的叶绿素含量统计情况见图3.10，图3.10（a）是所有样本叶片的叶绿素含量测定统计值，从该图能粗略的看出，样本叶片叶绿素含量分布在0.8-1.5mg/g 的范围内。（b）图是划分了训练集与预测集的叶绿素统计图，标记了叶绿素的最小值、最大值、平均值与标准偏差，从最小值与最大值可以总结出，训练集样本叶片的叶绿素含量分布范围是0.912-1.383mg/g，预测集样本叶片的叶绿素含量分布为0.950-1.427mg/g；训练集叶绿素含量平均值为 1.114mg/g，标准偏差是 0.122mg/g；预测集叶片的叶绿素平均值则1.151mg/g，标准偏差为0.123mg/g。